快速、准确的病原学诊断，能尽早选择敏感的抗感染药物或采取有效、具有针对性的防控措施，是感染性疾病精准化防治的核心。宏基因二代测序作为一种新兴的检测技术，能够不依赖微生物培养而检出临床样本中的所有微生物，该技术已在国内被广泛应用，并展现了其快速、无偏倚和高检出的优势。
《中国临床医学》杂志第27卷第4期特设立“感染性疾病精准诊治”专题报道，收录了医院“感染-感控-微生物”团队多篇相关文章，以8篇文章的全篇幅，整体展现了其在疑难复杂感染的病原诊断、医院感染防控中的意义。
SIFIC团队特此专栏报道，今天为大家带来《MALDI-T0FMS直接靶板微滴生长法对耐碳青霉烯类肠杆菌的快速鉴别诊断价值》，医院感染团队为我们解读耐碳青霉烯类肠杆菌的快速鉴别诊断，希望您能从中获益。
MALDI-T0FMS直接靶板微滴生长法对耐碳青霉烯类肠杆菌的快速鉴别诊断价值
作者：沈佳瑾，*声雷，周春妹，胡必杰，郭玮
单位：医院感染病科、医院感染管理科
目的：探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometry,ＭALDI-TOFＭS)直接靶板微滴生长法(direct-on-targetmicrodropletgrowthassay(DOT-ＭGA)对快速鉴别耐碳青霉烯类肠杆菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae,CRE)的价值。
方法：收集32株大肠埃希菌和28株肺炎克雷伯菌(将菌液与含有单种抗菌药物(亚胺培南、美罗培南或厄他培南)的肉汤在靶板上混合作为检测孔(与不加抗菌药物的肉汤混合作为生长对照孔((35±1)℃分别孵育3h、4h、5h和6h后(根据VITEKＭS系统能否成功鉴定靶板上的待测菌，判断其是否对碳青霉烯类药物耐药。采用微量肉汤稀释法检测菌株的最小抑菌浓度，与DOT-ＭGA结果进行比较。
结果：肺炎克雷伯菌孵育至4h时，生长对照有效率为92.9%(DOT-ＭGA检测3种碳青霉烯类药物的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均为.0%。大肠埃希菌孵育至5h时，生长对照有效率为%，DOT-ＭGA检测亚胺培南、美罗培南和厄他培南的特异度及阳性预测值均为.0%，灵敏度依次为85.0%、70.0%和95.0%，阴性预测值依次为80.0%、66.7%和92.3%。肺炎克雷伯菌DOT-ＭGA结果与微量肉汤稀释法完全一致(Kappa=1)，大肠埃希菌则较好(厄他培南0.93，亚胺培南0.81)和一般(美罗培南0.64)。
结论：ＭALDI-TOFＭS鉴别CRE快速、准确、操作简便，特别是检测耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的准确性高，可为临床早期的抗菌药物靶向精准治疗提供帮助。
直接靶板微滴生长法；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；耐碳青霉烯类肠杆菌
细菌耐药已成为威胁全球公共卫生的一大难题，全国CHINET数据显示，—年耐碳青霉烯类肠杆菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)的比例持续上升，尤其是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药率上升幅度超过8倍，给临床治疗带来极大挑战。Idelevich等在年首次采用基于ＭALDIBiotyper系统的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometry，ＭALDI-TOFＭS)直接靶板微滴生长法(direct-on-targetmicrodropletgrowthassay，DOT-ＭGA)快速检测美罗培南的耐药性，该方法快速、通量大，近年来迅速发展。本研究首次使用VITEKＭS系统，并对现有DOT-ＭGA方法做出改进，选择的菌株为CRE中最常见且分离率最高的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，选择亚胺培南、美罗培南和厄他培南3种临床常用的碳青霉烯类药物，评估DOT-ＭGA快速鉴别CRE的准确性。
1，材料与方法
1.1菌株来源收集医院微生物实验室—年非重复菌株，大肠埃希菌32株，其中耐碳青霉烯类大肠埃希菌(carbapenem-resistantEscherichiacoli，CRECO)20株；肺炎克雷伯菌28株，其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)16株。
1.2仪器和试剂VITEKＭS质谱仪、VITEKＭS-CHCA基质液(a-氰基-4-羟基-肉桂酸)及VITEKＭS靶板购自法国生物梅里埃公司。PhoenixIDBroth及PhoenixSpec比浊仪购自美国BD公司。亚胺培南、美罗培南、厄他培南药敏试剂及CAＭHB肉汤(阳离子调节ＭH肉汤)购自温州康泰生物科技有限公司。哥伦比亚血琼脂平板购自上海科玛嘉微生物技术有限公司。
1.3微量肉汤稀释法菌株接种哥伦比亚血琼脂平板，(35±1)℃孵育18～24h后备用。挑取新鲜纯菌落于PhoenixIDBroth中，采用PhoenixSpec比浊仪调制0.5麦氏浊度菌悬液，并用CAＭHB肉汤进行1:稀释，使菌液终浓度为5×10^5CFU/mL。将稀释后的菌液分别接种于亚胺培南、美罗培南和厄他培南药敏试剂板条(3种药物浓度范围均为0.～μg/mL)，(35±1)℃孵育16～20h后按试剂说明书判读3种药物的最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration，ＭIC)，结果解释参照CLSI年Ｍ文件。用大肠埃希菌ATCC和铜绿假单胞菌ATCC(购自上海市临床检验中心)作为质控菌株。
1.4DOT-ＭGA用新鲜纯菌落配制0.5麦氏浊度菌悬液，与CAＭHB肉汤1:稀释，使菌液浓度为1×10^6CFU/mL。用CAＭHB肉汤稀释药敏试剂板条中的抗菌药物，静置30min使其充分溶解，调节药物浓度至亚胺培南4μg/mL、美罗培南4μg/mL、厄他培南2μg/mL。将3μL菌液和3μL药物溶液混合于VITEKＭS靶板孔内作为检测孔，形成终体积为6μL的微滴，同时用3μL菌液和3μL不加抗菌药物的CAＭHB肉汤混合作为生长对照孔。检测孔和生长对照孔的菌液终浓度为5×10^5CFU/mL，药物终浓度为亚胺培南2μg/mL、美罗培南2μg/mL、厄他培南1μg/mL。为防止微滴在孵育过程中挥发，需将靶板置于湿盒中，(35±1)℃分别孵育3h、4h、5h和6h。将生长对照孔的成功鉴定率作为生长对照有效率，简称有效率。通过DOT-ＭGA与微量肉汤稀释法结果的比较，计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值4个指标，评估DOT-ＭGA4个孵育时间的结果准确性。
1.5VITEKＭS质谱鉴定取出孵育完成的靶板，用移液器每孔吸去5μL液体，残留液体用加热板60℃烘干。按照VITEKＭS质谱仪标准化操作流程，将大肠埃希菌ATCC(由法国生物梅里埃公司提供)涂在靶板的校准点位，所有检测孔加1μLVITEKＭS-CHCA基质液，干燥后上机获取蛋白图谱。比较该图谱与数据库(SARAＭISＭS-RUOv4.15.0)已知图谱，经软件(SARAＭISPremiumv2.9.3)分析得出最终鉴定结果。
1.6结果判定标准软件评估鉴定可信度在75.0%～99.9%时，视为有效的鉴定结果；鉴定可信度＜75.0%时，无鉴定结果。当生长对照孔成功鉴定到种水平，即鉴定结果与目标菌一致且鉴定可信度在75.0%～99.9%时，DOT-ＭGA结果判定为有效，反之无效。在结果有效的条件下，由于微滴中的3种碳青霉烯类药物浓度为CLSI年Ｍ文件中规定的中介折点浓度，若检测孔成功鉴定到种水平，说明细菌在该浓度的抗菌药物环境中生长，视为耐药；若检测孔无鉴定结果，说明细菌在该浓度的抗菌药物环境中不生长，视为不耐药(敏感或中介)。
1.7统计学处理采用SPSS17.0进行统计学分析。采用连续校正X2检验比较有效率。采用Kappa检验评价DOT-ＭGA与微量肉汤稀释法结果的一致性。Kappa等于1认为两者完全一致；1＞Kappa≥0.75认为一致性较好；0.75＞Kappa≥0.4认为一致性一般；Kappa＜0.4认为一致性较差。检验水准(a)为0.05。
2、结果
2.1菌株ＭIC值分布结果(表1)显示：微量肉汤稀释法检测所有菌株的亚胺培南、美罗培南和厄他培南的ＭIC值。
表1实验菌株3种碳青霉烯类药物的MIC值分布
2.1肺炎克雷伯菌DOT-ＭGA检测结果结果(表2)显示：肺炎克雷伯菌孵育至4h时，有效率为92.9%(26/28)，DOT-ＭGA检测3种碳青霉烯类药物的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均为.0%，而有效率在孵育5h后也达到.0%。由于4h和5h的有效率差异无统计学意义(P=0.)，判断4h是DOT-ＭGA鉴别CRKP的最佳孵育时间。
表2肺炎克雷伯菌DOT-ＭGA检测结果
2.3大肠埃希菌DOT-ＭGA检测结果结果(表3)显示：大肠埃希菌孵育至5h时，有效率达.0%，DOT-ＭGA检测3种碳青霉烯类药物的特异度和阳性预测值均为.0%，亚胺培南的灵敏度为85.0%(17/20)、阴性预测值为80.0%(12/15)；美罗培南的灵敏度为70.0%(14/20)、阴性预测值为66.7%(12/18)；厄他培南的灵敏度为95.0%(19/20)、阴性预测值为92.3%(12/13)。因其孵育至6h的结果准确性无进一步提升，判断5h是用DOT-ＭGA鉴别CRECO的最佳孵育时间。
表3大肠埃希菌DOT-ＭGA检测结果
2.4一致性分析将2种肠杆菌科细菌在最佳孵育时间的DOT-ＭGA结果与微量肉汤稀释法进行一致性分析结果：肺炎克雷伯菌3种碳青霉烯类药物的DOT-ＭGA结果与微量肉汤稀释法完全一致(Kappa=1)，大肠埃希菌则表现为亚胺培南和厄他培南的一致性较好，且厄他培南(Kappa=0.93)优于亚胺培南(Kappa=0.81)，美罗培南一致性一般(Kappa=0.64)。
3、讨论
CRE感染与高死亡率密切相关，特别是CRE血流感染，其死亡率是非CRE血流感染的2～3倍。快速鉴别CRE有利于临床早期正确选择抗菌药物，降低患者死亡率。传统药敏试验需16～20h，耗时长；PCR法快速检测CRE只能识别特定、已知的碳青霉烯酶，对非产碳青霉烯酶机制或未知碳青霉烯酶导致的耐药则无法检测，且该方法对实验室和人员要求高，仪器价格昂贵；CarbaNP试验同样只能检测产碳青霉烯酶的CRE，且操作复杂，人为判读结果可能会有误差。采用ＭALDI-TOFMS快速鉴别CRE现有3种方法：(1)检测菌株与碳青霉烯类药物作用一段时间后的水解产物；(2)直接检测菌株的碳青霉烯酶质谱特征峰；(3)通过DOT-ＭGA评估菌株的ＭIC值，其中第1种和第3种方法可解决上述问题。
本研究选用DOT-ＭGA，参考Idelevich等得出的最佳微滴体积6μL，首次采用VITEKＭS系统代替ＭALDIBiotyper系统，并对现有方法做出了改进。其文章中使用特殊材质的纸巾通过毛细管效应去除孵育后靶板上的微滴。由于该材料不易获得，预实验时选用普通纸巾替代，但发现其吸水性不佳且会引起相邻孔位的污染。故本实验采用移液器吸去等量液体再用加热板烘干的方式，实验前期尝试了吸去4.5μL、5μL和5.5μL3种方案，最终发现吸去5μL液体的效果最好。
本研究主要评估了DOT-ＭGA在4个孵育时间点鉴别CRECO和CRKP的结果准确性。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌在孵育3h时的有效率为40.6%～67.9%，且DOT-ＭGA结果的重复性和准确性较差，不推荐作为常规检测方案。大肠埃希菌孵育5h、肺炎克雷伯菌孵育4h时DOT-ＭGA结果的准确性已达4个孵育时间的最高值，延长孵育至6h，质谱的鉴定可信度虽略有提升，但最终结果并无变化。
本研究中的28株肺炎克雷伯菌在孵育4h时，仅有2株黏液性菌株生长对照孔无鉴定结果，其余菌株的DOT-ＭGA结果与微量肉汤稀释法完全吻合，说明采用DOT-ＭGA鉴别CRKP的准确性高。在大肠埃希菌用此方法检测时，发现部分CRECO的假阴性，3种碳青霉烯类药物中厄他培南的准确性最高。20株CRECO在孵育5h时，有3株亚胺培南、6株美罗培南、1株厄他培南的DOT-ＭGA结果为不耐药，但在延长孵育时间至18h后全部耐药，可能由于某些碳青霉烯酶水解碳青霉烯类药物的速度较慢，且不同碳青霉烯类药物的作用位点及抗菌活性也有差异，短时间孵育的菌量尚达不到质谱检测的阈值，需要延长孵育时间才能得到准确的检测结果。本研究的菌株数量不多，且菌株的ＭIC值分布不均，实验结果可能有一定局限性，未来需加大菌株量来进一步完善。
DOT-ＭGA具有快速、原理简单、操作方便、实用性强等优点，运用相当广泛，除了鉴别CRE之外，还可检测其他菌株类型及其他抗菌药物的耐药性。有研究使用该方法筛选耐甲氧西林金*色葡萄球菌，或通过加和不加酶抑制剂的DOT-ＭGA结果差异进行ESBLs及AmpC酶的检测。此外，报阳后的血培养标本通过过滤、洗涤、离心等前处理，将富集的病原菌直接进行DOT-ＭGA检测，可在数小时内获得特定药物的耐药性结果与菌株鉴定结果。然而DOT-ＭGA作为一种新方法，其标准化和重复性有待考察，未来或许可以通过引人自动化系统或制造商品化药物冻干粉包被的靶板来解决这一问题。另外，DOT-ＭGA现仍处在研究的起步阶段，仍需继续扩大菌株类型、增加菌株数量、探索实验方案，来验证现有方法的可靠性和重现性，并继续扩展其在快速药敏检测领域的运用。
综上所述，采用ＭALDI-TOFＭS的DOT-ＭGA法鉴别CRE，快速、准确、操作简便，特别是检测CRKP的准确性高，可为临床早期的抗菌药物靶向精准治疗提供帮助。
参考文献：略（见原文）