作者:李映荷1,2，孟祥辰1，阎鹏光1，杨红1，李骥1，钱家鸣1，李景南1,2
单位:1医院消化内科2中国医学科学院肠道微生态与临床转化研究重点实验室
通信作者:李景南文章来源:协和医学杂志,,10(3):-.基金项目:国家自然科学基金();中国医学科学院医学与健康科技创新工程(-12M-3-)
炎性肠病(inflammatoryboweldisease,IBD)是一种慢性非特异性肠道炎症性病变，分型包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)，克罗恩病(Crohn＇sdisease,CD)以及未定型IBD。UC在中国IBD患者中最常见，其发病机制被认为是在遗传易感者中，异常环境因素驱动导致的黏膜免疫应答紊乱和黏膜屏障功能异常。
肠道菌群是一类与IBD密切相关的环境因素。大量动物实验和临床试验表明，肠道菌群在UC的发生、发展中起重要作用。与非IBD人群相比，UC患者的肠道菌群生物多样性减少，菌群组成存在显著差异，并随病变程度的不同而发生显著变化。
有研究发现，药物治疗会改变UC患者的肠道菌群组成];而相同治疗方案对具有不同肠道菌群患者的疗效也不尽相同。分析评估肠道菌群可能会成为预测药物疗效的潜在方法。目前关于糖皮质激素(glucocorticoid,GC)治疗与中重度UC患者肠道菌群关系的研究较少，两者之间相互影响的机制尚不明确。
本研究采用16SrRNA扩增子测序技术，对UC患者的粪便菌群进行测序和分析，探讨中重度UC患者在GC暴露与否的情况下，肠道菌群是否存在差别，并比较静脉激素治疗早期疗效不同患者间的肠道菌群差异。
1资料与方法
1.1研究对象及病情评估
回顾性分析年11月1日至年6月30日间在医院消化内科门诊就诊或住院治疗的UC患者。
纳入标准:
(1)符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(年，北京)》中UC的诊断标准;
(2)在医院消化内科规律随诊(每年至少随诊3次，包括门诊和住院);
(3)采集粪便样本时病情为中重度活动期,即Mayo评分≥6分。
排除标准:
(1)有结直肠手术史;
(2)采集粪便样本前两周内使用过抗生素;
(3)合并其他慢性胃肠道疾病，如胃肠道肿瘤、胃十二指肠溃疡、乳糜泻、肠易激综合征等;
(4)粪便真菌、细菌培养或难辨梭菌毒素检测阳性。
采用Mayo评分(包括患者采集粪便样本时的大便频率、便血情况、内镜发现和医师整体评价4个方面)评估疾病活动程度,所有评分均由同一医师盲评完成。根据蒙特利尔分型，肠道病变范围分直肠型(E1)，左半结肠型(E2)和全结肠型(E3)。
本研究通过医院伦理委员会审核(伦理号JS-)，所有患者签署知情同意书。
1.2分组
根据采集粪便时患者的激素暴露情况，将入选患者分为激素组(采样时正在接受GC治疗)和无激素组(采样时未使用GC)。进一步观察无激素组患者入院后接受足量静脉激素(即甲基泼尼松龙46~60mg/d或琥珀酰氢化可的松~mg/d)治疗的情况，根据治疗3d后排便频率、血便量及血清炎症指标是否改善，将患者分为治疗有效组和治疗无效组:治疗3d后排便次数＞8次/d，或排便次数3~8次/d且C反应蛋白＞45mg/L，为治疗无效;排便次数≤3次/d，血便较前减少且到第7d时基本无肉眼血便，临床症状改善，为治疗有效。
1.3粪便样本采集
于肠镜检查前1~2d内、肠道准备前收集粪便样本。粪便样本储存于粪便采集管中(德国SARSTEDT公司，货号)，严格按照产品说明书操作，每管采集3~8ml粪便样本，收集后2h内送至-80℃冰箱保存。
1.4DNA提取、扩增、测序及分析
采用粪样基因组提取试剂盒(E.Z.N.A.TMstoolDNAisolationKit，OmegaBio-Tek公司，美国)提取粪便DNA，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取到的DNA纯度和质量。细菌16SrRNA基因的V3-4高可变区扩增引物如下:通用引物F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。引物5端连接一段长度为10个碱基的接头序列，用于后续高通量测序。扩增产物通过胶回收试剂盒(QIAquickGelExtractionKit，QIAGEN公司,德国)提纯，并采用实时荧光定量PCR分析。基因高通量测序由北京Allwegene公司通过Miseq平台完成，扩增后的图像分析、碱基识别及误差估计采用IlluminaAnalysisPipeline(版本2.6)完成，剔除原始数据中DNA长度小于bp、质量评分≤20、含有歧义碱基或测序结果、与初始引物序列及接头序列不匹配的数据。采用QuantitativeInsightsIntoMicrobialEcology(2.1版本，RobKnight实验室和GregCaporaso实验室，美国)完成微生物多样性分析，其中相似度在97%及以上的测序条带被聚类为一个操作分类单元(operationaltaxonomicunits,OTUs)，将最终得到的所有OTUs导入数据库RibosomalDatabaseProject中进行物种分类。
1.5统计学处理
采用SPSS19.0等软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表达，计数资料采用百分数表示。t检验用于比较不同组患者年龄是否存在差异，卡方检验用于比较不同组患者的性别、疾病类型及病情活动度的构成比。主成分分析(principal