活的但不可培养的状态（Viablebutnonculturable,VBNC）细菌是指处于代谢活性非常低的状态并且不分裂、但一旦被复苏就具有存活能力并且能够变得可培养的细菌。VBNC状态是年首次发现的，这是一种独特的状态，在这种状态下，许多细菌会对不利的环境做出反应。
进入VBNC状态后，传统的平板计数技术无法检测到食源性致病菌。据报道，在食品加工和保藏过程中的极限环境条件，如极端温度、干燥、辐照、脉冲电场和高压应力，以及添加防腐剂和消*剂，都可以诱导许多食源性病原菌进入VBNC状态，将给食品安全和公共卫生带来严重的危机。
研究表明，许多病原体和非病原体都可以进入VBNC状态，例如嗜水气单胞菌、根癌农杆菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、空肠弯曲菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌(包括肠出血性大肠杆菌)、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺*团菌、单核细胞增生性李斯特菌、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌等。
许多人认为，处于VBNC状态的病原体尽管保留了它们的*力特性，但不能诱导感染/疾病。然而，不少研究已经表明，当VBNC病原体到达宿主后，复苏和新陈代谢活动的恢复会导致感染和疾病。例如VBNCO1霍乱弧菌在兔回肠循环试验(RICA)和人类志愿者实验中均呈现了明显的*性。可见，VBNC状态的病原体，或与相当多无法培养出病原体的感染和疾病呈密切相关。
VBNC的传统检测技术萘啶酸处理后，用明场显微镜观察萘啶酸（20–40mg/L）可使细胞停止分裂。暴露于萘啶酸后，活细胞继续生长，形态延长，而无代谢活性的细胞将保持其原始形状和大小，此时，在显微镜下观察细胞，就会发现活细胞的形态拉长，而VBNC/休眠细胞则偏椭圆形。
荧光显微镜各种荧光染色方法可用于确定VBNC状态。常用的染色剂有吖啶橙、4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、异硫氰酸荧光素（FITC）、吲哚-硝基苯基-苯基氯化四氮唑（INT）和5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四氮唑（CTC）。下表总结了这些染料的作用方式和观察到的反应。
染料
机制
反应
吖啶橙
染色反应取决于细胞中DNA与蛋白质的比例活跃繁殖的细胞呈绿色，但染色时生长缓慢或非繁殖的细胞呈橙色二氨基苯基吲哚（DAPI）差异染色活细胞在荧光显微镜下呈绿色吲哚-硝基苯基-苯基氯化四氮唑（INT）INT与脱氢酶反应生成甲瓒呈红色
活细胞呈现红色
异硫氰酸荧光素（FITC）活细胞中的酶活性FITC将活细胞染成紫色或蓝色近年来，还出现了一种新的差异染色测定法，即BacLight活/死测定法。通过使用两种核酸染色剂，即绿色荧光的SYTO9染色剂和红色荧光的碘化丙啶染色剂，该测定法可以同时计数总细胞和存活（代谢活性）细胞。SYTO9可以染色活细菌和死细菌，而碘化丙啶只能穿透膜受损的细菌。当一起使用时，碘化丙啶可降低膜受损的死细菌的SYTO9荧光，导致死细菌呈红色，而活细菌则发出绿色荧光。
分子技术杂交探针是经过化学或放射性标记的核酸（DNA/RNA），可用于检测互补靶标DNA/RNA。只要使用适当的独特引物，即可从环境和临床样品的DNA提取物中特异性扩增DNA靶标，无需进行培养即可检测特定生物或相关生物组，但检测DNA不能区分目标生物体的可培养形式和不可培养形式。而逆转录酶PCR（RT-PCR）可以区分活细胞和死细胞，原理基于mRNA（mRNA寿命短，半衰期少于1分钟）。mRNA仅存在于具有代谢活性的细胞中，而在细胞死亡后便不存在。也可使用不同类型的印迹（例如菌落印迹、缝隙印迹、斑点印迹和Southern印迹）直接从环境样品中检测VBNC细胞。印迹的原理是使用放射性或非放射性或荧光标记探针。荧光原位杂交（FISH）是杂交探针的另一种形式，其中荧光标记的DNA或RNA探针与靶标核酸在整个透化细胞中杂交。通过将rRNA靶向的探针与落射荧光显微镜结合使用，该方法可用于检测单个微生物细胞。这是通过选择性靶向rRNA的区域来完成的，通过选择适当的rRNA探针序列，FISH可用于检测VBNC的所有细菌细胞（通用探针）或单个细胞群（菌株特异性探针）。但灵敏度较低，无法区分活细胞和死细胞。
成像流式给VBNC检测带来了什么革命性突破？年，Morishige等人建立了一种简便、快速的VBNC沙门氏菌代谢活性的方法，测量了3种不同的代谢活性：5-氰基-2，3-二苯基四唑氯(CTC)还原测定的呼吸活性，2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxyglucose(2-NBDG)测定的葡萄糖摄取活性，以及5-乙炔基-2‘-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)掺入测定的DNA合成活性。在此研究中，Morishige同时用了共聚焦激光扫描显微镜和常规流式细胞仪。两个平台的结合，对实验结果是较好的完善和补充，但也给实验结果的汇总统计带来一定的困难。
如果有了成像流式细胞仪，那么就会变得不同了，图像和功能指标就能得到很好的统一，真正做到「一次处理，多类指标」，不仅克服了VBNC的检测难题，从多方面给出客观数据，而且极好的体现了流式技术的快速优势。
光说不练假把式。
年，DeyR等人利用成像流式细胞仪ImageStreamMkII分析了条件致病菌「铜绿假单胞菌」及其与自由生活的多食阿米巴相互作用的报告。铜绿假单胞菌能够对各种环境条件(包括饮用水管道中存在的物质)做出反应，进入VBNC状态，从而防止抗生素等杀菌剂对其的杀伤作用。对于许多重要的人类病原体，包括但不限于铜绿假单胞菌，VBNC细菌的准确检测和定量一直非常困难。该研究中，作者发现，转染了GFP的铜绿假单胞菌，GFP荧光强度在进入VBNC状态后5个月仍保持稳定，使用成像流式，根据形态和大小很轻松区分VBNC状态和活性状态（VBNC细菌呈典型的圆形，而活性细菌呈细长/杆状）。在下图中，滋养体内共培养的VBNC细胞能够恢复到可培养状态（活性状态），与阿米巴共培养2小时后，活性铜绿假单胞菌的数量增加了3个log(A图）；没有阿米巴的这组也出现类似的结果，不过速度很慢（B图）。除了常规信号，A、B两个图下方由成像流式细胞仪同步采集的图像，更好的显示了R2门内的VBNC状态和非R2门内的活性状态：
年，ChenS等人使用配备有氩激光（nm，15mW）的成像流式细胞仪FlowSight进行活细菌和VBNC细菌的计数，同样采用了Morishige等人使用的CTC染料，因为该染料在细菌呼吸过程中，很容易还原为不溶于水、发红色荧光的甲瓒。步骤也很简单，将2毫升CTC溶液添加到ul大肠杆菌悬浮液中，以使最终CTC浓度达到2mM，然后在37°C的黑暗环境中孵育4小时即可上机。就这样，作者不仅发现了大肠杆菌在不同浓度氯气或氯胺作用下容易进入VBNC状态，并且利用成像流式对不同状态的大肠杆菌动态变化进行监测，描述了可培养大肠杆菌诱导进入VBNC状态的动力学过程，给出了预测VBNC大肠杆菌数量的数学模型，模型的预测结果与可培养细胞、活细胞、死亡细胞和VBNC细胞数的实测值吻合较好，因此较好的解决了目前饮用水管理系统研究的一个主要焦点。
由这两篇典型的代表文献可见，在VBNC细菌的鉴别上，成像流式能够从细菌形态、荧光染料等多指标上同时分析，并且节省大量的时间，从而较其它实验手段有着极大的优势，值得食品安全和公共卫生相关专业的FLOWER在研究中采用。
参考文献Xu,H.S.,Roberts,N.,Singleton,F.L.,Attwell,R.W.,Grimes,D.J.,andColwell,R.R.().SurvivalandviabilityofnonculturableEscherichiacoliandVibriocholeraeintheestuarineandmarineenvironment.Microb.Ecol.8,–.doi:10./BF
Md.Fakruddin,KhanjadaShahnewajBinMannan,StewartAndrews,"ViablebutNonculturableBacteria:FoodSafetyandPublicHealthPerspective",InternationalScholarlyResearchNotices,vol.,ArticleID,6pages,.